Metaganomica Completa

Autor/a

OMICs Analysis

Pipeline metagenómica (directorios y archivos)

~/2025_demo_metagenomics/
├─ SRR1986202_1.fastq.gz
├─ SRR1986202_2.fastq.gz

Preparar el workspace

cd ~/2025_demo_metagenomics
mkdir -p megahit_out metaquast_out mapping_out metabat_bins gtdbtk_out prokka_out kofam_out prodigal_out

Ensamblado con MEGAHIT (paired-end)

Input

  • SRR1986202_1.fastq.gz y SRR1986202_2.fastq.gz

Output (principales)

  • megahit_out/final.contigs.fa (FASTA con contigs)
  • megahit_out/log (logs y archivos intermedios)

Comando

megahit -1 SRR1986202_1.fastq.gz -2 SRR1986202_2.fastq.gz -t 8 -o megahit_out

(MEGAHIT detecta paired-end con -1 y -2).

head -n 5 megahit_out/final.contigs.fa

>contig_1 len=51234 cov=37.9
ATGCTAGCTAGCTGACTGATCGATCGATGCTAGCTAGCATCGATCGATCGATCG
>contig_2 len=18421 cov=12.4
GGTACGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGGCTAGCTAGCTAGCTAGC

Evaluación del ensamblado con MetaQUAST

Input

  • megahit_out/final.contigs.fa

Output

  • metaquast_out/report.html (informe HTML)
  • metaquast_out/report.tsv (tabla resumida)
  • metaquast_out/plots/ (gráficas)

Comando

metaquast.py megahit_out/final.contigs.fa -o metaquast_out -t 8

(MetaQUAST es la versión de QUAST orientada a metagenomas).

head -n 5 metaquast_out/report.tsv

Assembly    #contigs    Total_length    Largest_contig  N50
megahit_out/final.contigs.fa    142 6,102,345   312345  61,230

Mapear lecturas al ensamblado (Bowtie2 + samtools) — necesario para coverage/depth

Input

  • megahit_out/final.contigs.fa
  • SRR1986202_1.fastq.gz, SRR1986202_2.fastq.gz

Output

  • mapping_out/sample.sorted.bam (BAM ordenado)
  • mapping_out/sample.sorted.bam.bai (index)
  • mapping_out/sample.sam (si no se pipelínea)

Comandos

# Indexar el ensamblado para Bowtie2
bowtie2-build megahit_out/final.contigs.fa mapping_out/megahit_contigs

# Mapear pares (paired-end)
bowtie2 -x mapping_out/megahit_contigs -1 SRR1986202_1.fastq.gz -2 SRR1986202_2.fastq.gz -S mapping_out/sample.sam -p 8

# Convertir a BAM, ordenar e indexar
samtools view -bS mapping_out/sample.sam | samtools sort -@8 -o mapping_out/sample.sorted.bam
samtools index mapping_out/sample.sorted.bam

(Usamos Bowtie2 para mapping; luego samtools para manejo de BAM).

samtools view mapping_out/sample.sorted.bam | head -n 5 (formato SAM->BAM mostrado como SAM)

SRR1986202_1    99  contig_1    1345    60  100M    =   1420    175 ACTG... IIII...
SRR1986202_2    147 contig_1    1420    60  100M    =   1345    -175    ACTG... IIII...
SRR1986202_1    99  contig_2    58  42  90M =   0   0   ACTG... IIII...
SRR1986202_2    147 contig_2    147 42  90M =   0   0   ACTG... IIII...

Calcular cobertura por contig (jgi_summarize_bam_contig_depths) — para MetaBAT2

Input

  • mapping_out/sample.sorted.bam (BAM indexado)
  • megahit_out/final.contigs.fa

Output

  • mapping_out/depth.txt (tabulado: contig vs depth por muestra)

Comando (ejemplo de 1 muestra)

# jgi_summarize_bam_contig_depths está en la distribución de MetaBAT2
jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth mapping_out/depth.txt mapping_out/sample.sorted.bam

(Este script resume la profundidad media por contig y la escribe en un formato que usa MetaBAT2).

head -n 6 mapping_out/depth.txt

contig  sample1
contig_1    150.23
contig_2    45.78
contig_3    0.00
contig_4    12.34

Binning con MetaBAT2

Input

  • megahit_out/final.contigs.fa
  • mapping_out/depth.txt

Output

  • metabat_bins/bin.1.fa, metabat_bins/bin.2.fa, … (cada archivo = MAG candidate)
  • logs en metabat_bins/

Comando

metabat2 -i megahit_out/final.contigs.fa -a mapping_out/depth.txt -o metabat_bins/bin -t 8

(Generará metabat_bins/bin.1.fa, bin.2.fa, …).

head -n 6 metabat_bins/bin.1.fa

>bin.1_contig_5 len=312345 cov=45.6
ATGCTAGCTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGC
>bin.1_contig_21 len=10234 cov=43.1
GGCATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGA

Evaluación de calidad de MAGs con CheckM (recomendado)

Input

  • Directorio con bins metabat_bins/ (cada *.fa).

Output

  • checkm_out/ con lineage.ms y checkm.report (tabla con completeness, contamination, strain-heterogeneity).

Comando

checkm lineage_wf -t 8 -x fa metabat_bins checkm_out

(Comando común para obtener completeness y contamination por bin).

checkm_out/checkm.report (primeras 5 líneas)

Bin Completeness    Contamination   Strain heterogeneity
bin.1   96.3    1.2 0.0
bin.2   45.0    5.6 12.5
bin.3   88.7    2.1 0.0

Clasificación taxonómica de los MAGs con GTDB-Tk

Input

  • metabat_bins/ (los *.fa con cada bin)

Output

  • gtdbtk_out/ con subdirectorios classify/ y archivos como gtdbtk.bac120.summary.tsv, gtdbtk.bac120.classification.tsv y reportes *.tsv.

Comando (workflow recomendado)

gtdbtk classify_wf --genome_dir metabat_bins --out_dir gtdbtk_out --extension fa --cpus 8

(GTDB-Tk ejecuta ani_screen, identify, align, classify y produce resúmenes por genoma).

head -n 6 gtdbtk_out/gtdbtk.bac120.summary.tsv

user_genome classification  fastani_ref
bin.1.fa    p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Alteromonadales; f__Alteromonadaceae; g__Alteromonas  ref_XYZ
bin.2.fa    p__Actinobacteriota; c__Actinobacteria; o__Actinomycetales  ref_ABC

Predicción de genes/proteínas con Prodigal (modo metagenómico)

Por qué: kofamSCAN requiere secuencias de proteínas (aminoácidos) como input (FASTA de AA). Para obtenerlas a partir de contigs/bins usamos Prodigal en modo metagenómico.

Input

  • Cada bin FASTA: metabat_bins/bin.1.fa (o el ensamblado completo si prefieres)

Output

  • prodigal_out/bin.1.faa — secuencias proteicas (AA)
  • prodigal_out/bin.1.ffn — secuencias de genes (nt)
  • prodigal_out/bin.1.gbk — (opcional) GenBank

Comando (ejemplo por bin)

# modo meta para metagenomas
prodigal -i metabat_bins/bin.1.fa -a prodigal_out/bin.1.faa -d prodigal_out/bin.1.ffn -o prodigal_out/bin.1.gbk -p meta

head -n 6 prodigal_out/bin.1.faa

>gene_00001 hypothetical protein [bin.1]
MARMKQLYVALLLGVV...
>gene_00002 transcriptional regulator [bin.1]
MTEYKLVVVGAG...

Anotación con kofamSCAN (KOfam / KEGG orthology HMMs)

Requisitos previos

  • Base KOfam (perfiles HMM y ko_list) descargada desde el FTP de KEGG (p.ej. profiles/ y ko_list) — la README indica descargar profiles.tar.gz y ko_list.gz.
  • kofam_scan (repo/exec_annotation).

Input

  • prodigal_out/bin.1.faa (FASTA de proteínas)
  • Base de perfiles KOfam: por ejemplo en /path/to/kofam_db/profiles y /path/to/kofam_db/ko_list

Output

  • kofam_out/bin.1.kofam.detail.tsv (formato detallado) o kofam_out/bin.1.kofam.mapper (formato mapper para KEGG Mapper) según -f
  • posibles alineamientos temporales en --tmp-dir

Comando (ejemplo: formato mapper y detalle-tsv, 8 CPUs)

# opcion 1: formato detalle (más info)
exec_annotation -o kofam_out/bin.1.kofam.detail.tsv --cpu 8 --profile /path/to/kofam_db/profiles --ko-list /path/to/kofam_db/ko_list -f detail-tsv prodigal_out/bin.1.faa

# opcion 2: formato mapper (resumen KO por gen)
exec_annotation -o kofam_out/bin.1.kofam.mapper --cpu 8 --profile /path/to/kofam_db/profiles --ko-list /path/to/kofam_db/ko_list -f mapper prodigal_out/bin.1.faa

(En algunos paquetes el script principal se llama exec_annotation; puedes también usar kofam_scan dependiendo de tu instalación. Revisa --help si usas la versión empaquetada).

head -n 6 kofam_out/bin.1.kofam.mapper

gene_00001  K00001
gene_00003  K03456
gene_00007  K00015

head -n 6 kofam_out/bin.1.kofam.detail.tsv

gene_id K_number    threshold   score   E-value definition
gene_00001  K00001  100.0   145.3   1e-50   Example KO definition ...
gene_00003  K03456  85.0    90.2    2e-20   Another KO ...

Resumen final y archivos importantes en ~/2025_demo_metagenomics

./SRR1986202_1.fastq.gz, ./SRR1986202_2.fastq.gz   # inputs raw
./megahit_out/final.contigs.fa                      # ensamblado MEGAHIT
./metaquast_out/report.html                         # evaluación ensamblado
./mapping_out/sample.sorted.bam                     # mapeo lecturas->contigs
./mapping_out/depth.txt                             # coverage per contig para binning
./metabat_bins/bin.*.fa                             # bins (MAGs)
./gtdbtk_out/                                       # clasificación taxonómica
./prodigal_out/*.faa                                # proteínas llamadas con Prodigal
./kofam_out/*.kofam.*                               # anotación kofamSCAN (KO assignments)